標準AAVベクターを用いた染色体中のAAVベクターコピー数測定法に関する標準操作手順書

1. 目的

1.1

本標準操作手順書は標準アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いて、染色体中のAAVベクターコピー数の測定法について述べたものである。

1.2

本試験で用いるAAVベクター感染細胞の調製は               の記載に従う。

1.3

本試験で用いるAAVベクターを含むgenomic DNAの調製は               の記載に従う。

1.4

本試験で用いるサーマルサイクラー（MJ Research, PTC-200）の詳細な取扱いは               に、デンシトグラフ（アトー, AE-6920M-03型）の詳細な取扱いは               に従う。

1.5

本試験で用いるPCR法によるAAVベクターの高感度検出法はVirus Bank SOP-AAV-001の記載に従う。

1.6

本試験で用いる標準AAVベクター調製法はVirus Bank SOP-AAV-002の記載に従う。

2. 原理

2.1

標準AAVベクターを用いてPCR法により、標準曲線を作成し、染色体中のAAVベクターコピー数の測定を行うものである。

3. 試薬類

3.1

TaKaRa LA Taq（5 U/μl）、10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free）、25 mM MgCl₂、2.5 mM each dNTP mixture（#RR002A）は宝酒造、分子量マーカー1 kb Ladder（#15615-016）、50×TAE Buffer（#24710-030）、10 mg/mlエチジウムブロマイド溶液（#15585-011）はGIBCO BRL社、アガロース（#A6013）はSigma社製を使用する。

4. 標準AAVベクター希釈液の調製

4.1

TA-cloning 法により調製した標準AAVベクターを10⁷から10⁴コピー/μlに段階希釈する。希釈液は用時調製とする。希釈溶液の凍結保存したものを標準液として用いてはならない（DNAのチューブ壁への吸着による感度低下が示唆されたため）。

5. 被検サンプルの調製

5.1

染色体DNA中のAAVベクターコピー数の測定には、標準AAVベクターの検量線の直線領域内で測定できるように段階希釈する。被検サンプルによっては、三段階の10倍希釈系列を作成し予備検討を行う。

6. 操作手順

6.1

標準AAVベクターならびに被検サンプル希釈液1 μlを鋳型として用い、各サンプルは二連でPCRを行う。

　

PCRは以下の方法で実施する。即ち、下記の組成の内、Template DNAを除いた49 μlのPCR溶液を200 μl反応用チューブに分注し、1 μlのTemplate DNAを添加する。下記に示すプログラムを設定したサーマルサイクラーによりPCRを実施する。なお、全ての操作において手袋を着用し、試薬類は氷上に置く。

      ●PCR溶液（1サンプル当たり）

      ●PCRにおけるサーマルサイクラーのプログラム

6.2

PCR終了後のPCR産物の検出はアガロースゲル電気泳動により実施する。標準AAVベクターと各染色体DNAの希釈サンプルは、同一ゲル上で泳動する。PCR産物5 μlに6×Gel-loading buffer（0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/30% glycerol）を1 μl添加し、そのうちの5 μlをゲルにアプライして1×TAEバッファー中、100 Vで30分間泳動する。

6.3

終濃度2 μg/mlのエチジウムブロマイドを添加したミリQ水に電気泳動後のゲルを浸し、室温で5分間放置する。その後、水道水で5分間洗浄する。UV（312 nm）照射により、デンシトグラフ（アトー、AE-6920M-03型）にライブ画像を取り込んだ後、解析ソフトウエア「ゾーンデンシトメトリー」により約4 KbのPCR産物のバンドの蛍光強度を定量する。データはExcelのテキストファイルとして保存する。

7. 計算

7.1

ゾーンデンシトメトリーによる解析データをコンピューターソフトウエア"Microsoft Excel 5.0"を用いて、コピー数が既知の標準AAVベクターを鋳型として得られるPCR産物の蛍光強度から検量線を作成し、その検量線からAAVベクターのコピー数を算出する。

7.2

プリントアウトし、必要事項を記入し報告用紙とする。