標準AAVベクター調製法に関する標準操作手順書

1.目的

1.1

本標準操作手順書は、染色体中のアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターコピー数の測定に用いる、標準AAVベクターの調製法について述べたものである。

1.2

本試験で用いるAAVベクター感染細胞の調製は            の記載に従う。

1.3

本試験で用いるAAVベクターを含むgenomic DNAの調製は            の記載に従う。

1.4

本試験で用いるサーマルサイクラー（MJ Research, PTC-200）の詳細な取扱いは            に、デンシトグラフ（アトー, AE-6920M-03型）の詳細な取扱いは            に従う。

1.5

本試験で用いるPCR法によるAAVベクターの高感度検出法はVirus Bank SOP-AAV-001の記載に従う。

2. 原理

2.1

AAVベクターが組み込まれた組換え293細胞である2V8由来の約4 kbpのPCR産物を、TA-cloning 法によりpT7Blue T-Vector（Novagen社）に導入し、大腸菌JM109株を形質転換し、2V8由来のAAVベクター断片のクローン化を行い、組換えプラスミドよりAAVベクターを調製し、標準AAVベクターとする。

3. 試薬類

3.1

pT7Blue T-Vector（NV004, Novagen）、 TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2（#6022）、E.coli JM109 Competent Cell（#9052）、 TaKaRa Ex Taq（5 U/μl）、10×Ex PCR Buffer（#RR001A）、TaKaRa LA Taq（5 U/μl）、10×LA PCR Buffer（Mg²⁺ Free）、25 mM MgCl₂、2.5 mM each dNTP mixture（#RR002A）は宝酒造（株）、制限酵素PvuII（#151CS）はNEW ENGLAND BioLabs社、QIAGEN Plasmid Midi Kit（#12145）、QIAquick PCR Purification Kit（#28104）はQIAGEN社、 GenElute Minus EtBr Spin Column（# 5-6510）はSigma社、分子量マーカー1 kb Ladder（#15615-016）、50×TAE Buffer（#24710-030）、10 mg/mlエチジウムブロマイド溶液（#15585-011）はGIBCO BRL社、アガロース（#A6013）はSigma社製を使用する。

4. 標準AAVベクターの調製

4.1

PCR法により増幅した2V8由来の約4 kbpのPCR産物をQIAquick PCR Purification Kitにて精製し、pT7Blue T-VectorへTaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2を用いて導入した。大腸菌JM109株を形質転換し、組換え菌を得る。

4.2

インサートDNAの確認は、X-galを用いたBlue/Whiteスクリーニングにより白色コロニーを選択し、そのクローンを直接PCRによってインサートの有無を確認する。PCR反応は以下の方法で実施する。即ち、30 μl の滅菌蒸留水を200 μl反応用チューブに分注し、白色コロニーのクローンを懸濁し、下記の組成のPCR溶液を20 μl 添加する。下記に示すプログラムを設定したサーマルサイクラーによりPCRを実施する。なお、全ての操作において手袋を着用し、試薬類は氷上に置く。

      ●PCR溶液（1サンプル当たり）

      ●PCRにおけるサーマルサイクラーのプログラム

4.3

PCR終了後、PCR産物の検出はアガロースゲル電気泳動により実施する。PCR産物5 μlに6×Gel-loading buffer（0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/30% glycerol）を1 μl添加し、そのうちの5 μlをゲルにアプライして1×TAEバッファー中、100 Vで30分間泳動する。

4.4

終濃度2μg/mlのエチジウムブロマイドを添加したミリQ水に電気泳動後のゲルを浸し、室温で5分間放置する。その後、水道水で5分間洗浄する。UV（312 nm）照射により、DNAを検出する。必要であれば、デンシトグラフ（アトー、AE-6920M-03型）に画像を取り込んでおく。

4.5

約4 kbpのAAVベクター断片が導入されたクローンを培養し、QIAGEN Plasmid Midi Kit（QIAGEN）にてAAVベクターを有するプラスミドを大量調製する。制限酵素PvuIIにより消化し0.7% Agarose Gelにて電気泳動を行い、約4 kbpのインサートDNAを切り出す。GenElute Minus EtBr Spin Column（シグマ）を用いて標準AAVベクターを精製した後、A260 nmを測定しDNA濃度を求め、AAVベクター断片の長さと、分子量（1b=330）からコピー数を算出する。

4.6

標準AAVベクターを10⁹から10²コピー/μlに段階希釈する。それぞれ調製した希釈液1 μlを用いてPCR反応を行う。染色体DNA中のAAVベクターのコピー数を測定するためには、標準AAVベクターの検量線の直線領域内で測定できるように、測定限界濃度と直線領域の濃度範囲を求める。

4.7

測定例を以下に示す。