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Recombinant Virus Database

Virus Bank SOP-AAV-001

PCR法によるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの高感度検出法に関する標準操作手順書

1.目的

1.1
本標準操作手順書はPCR法によるアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの高感度検出法について述べたものである。

1.2
本試験で用いるAAVベクター感染細胞の調製は                  の記載に従う。

1.3
本試験で用いるAAVベクターを含むgenomic DNAの調製は                        の記載に従う。

1.4
本試験で用いるサーマルサイクラー(MJ Research, PTC-200)の詳細な取扱いは                        に、デンシトグラフ(アトー, AE-6920M-03型)の詳細な取扱いは                        に従う。

2. 原理

2.1
AAVベクター感染細胞よりgenomic DNAを調製し、これを鋳型としてITR(Inverted Terminal Repeat)領域に設定したプライマーを用いたPCR法により、外来遺伝子発現ユニットを含むAAVベクター領域を増幅し、アガロースゲル電気泳動にてAAVベクターの検出を行うものである。

3. 試薬類

3.1
TaKaRa LA Taq(5 Uμl)、10×LA PCR Buffer(Mg2+ Free)、25 mM MgCl2、2.5 mM each dNTP mixture(#RR002A)は宝酒造(株)、分子量マーカー1 kb Ladder(#15615-016)はGIBCO-BRL社、50×TAE Buffer(#24710-030)はGIBCO BRL社、10 mg/mlエチジウムブロマイド溶液(#15585-011)はGIBCO BRL社、アガロース(#A6013)はSigma社製を使用する。

4. PCRプライマーの調製

4.1
AAV genome DNAのITR領域に設定したITR-AD30: 5'-GAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT-3'を用い、滅菌蒸留水に終濃度100 μMとなるように溶解する。

5. 操作手順

5.1
PCR反応は以下の方法で実施する。即ち下記の組成の内、Template DNAを除いた49 μlのPCR溶液を200 μl反応用チューブに分注し、1 μlのTemplate DNAを添加する。下記に示すプログラムを設定したサーマルサイクラーによりPCRを実施する。なお、全ての操作において手袋を着用し、試薬類は氷上に置く。

      ●PCR溶液(1サンプル当たり)

      

      ●PCRにおけるサーマルサイクラーのプログラム

      

5.2
PCR終了後のPCR産物の検出はアガロースゲル電気泳動により実施する。泳動ゲルは以下の通り調製する。即ち、ミリQ水で希釈した1×TAE Bufferに懸濁したアガロース(1%、w/v)を電子レンジ等により加熱し、完全にアガロースが溶解したのを確認し、室温で固まらない程度まで冷却する。Mupid-2ゲルメーカーセット(アドバンス、#EM-2)にアガロースを流し込む。大プレート(W 107×L 60 mm)の場合35 ml、小プレート(W 52×L 60 mm)の場合は18 ml使用する。コーム(アドバンス、#COMB25、大プレート25ウェル、小プレート12ウェル)をセットしアガロースが固まるまで放置する。PCR産物5 μlに6×Gel-loading buffers(0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/30% glycerol)を1 μl添加し、そのうちの5 μlをゲルにアプライして1×TAEバッファー中、100 Vで30分間泳動する。

5.3
終濃度2 μg/mlのエチジウムブロマイドを添加したミリQ水に電気泳動後のゲルを浸し、室温で5分間放置する。その後、水道水で5分間洗浄する。UV(312 nm)照射により、デンシトグラフ(アトー、AE-6920M-03型)にライブ画像を取り込んだ後、PICTファイルとして保存する。

5.4
測定例を以下に示す。


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2010.05.19