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組換えアデノウイルスに関して

当開発室では、国内ならびに海外において産出された遺伝子材料の寄託をうけ、検定後保存し品質管理したリソースを提供しています。本組換えアデノウイルスは、研究で実際に使用されたクローンならびに当開発室で独自に開発したクローンを収集しており、他にはないユニークなものが多数あります。

組換えアデノウイルスを受取ったら
組換えアデノウイルスを受取ってから精製するまでの手順の概要です。操作手順の詳細は、「組換えウイルス標準操作手順書集(日本語)」「挿入遺伝子とRCAの確認」をご覧下さい。また、操作手順は「組換えアデノウイルス作製マニュアル ~クローン化ゲノム導入法~」にも記載されています。

  1. 組換えアデノウイルスの増幅
      理研DNA Bankが提供する組換えアデノウイルスはウイルス感染細胞ライセートとしてお送り致します。力価は測定していませんが,おおよそ106-8 pfu/mlの液を100 μl お送りいたします。お受け取り後は直ちに培養を開始してください。直ちに培養ができない場合は-80℃で保管し、なるべく早く培養して下さい。

      操作方法)
      10 cmコラーゲンコートディッシュに培養した293 細胞(培養液10ml, 約9x106 cells)を用意する。
      ウイルス液を100 μl感染させる(「組換えアデノウイルス作製マニュアル ~クローン化ゲノム導入法~」Protocol C-1 ,3, 4 次ウイルス感染プロトコール参照)。
      約3~4 日後に細胞が死滅したら、約10mlの培養液を細胞ごと(死滅細胞ごと)50 mLチューブに回収する。すぐに使わない場合は粗ウイルス液としてそのまま-80℃に保存する。すぐに使用する場合は、密閉超音波破砕または凍結融解し、ウイルスを遊離させ,9,400 g、10 分、4℃で遠心して上清を回収しウイルス液として使用する(ウイルス液約10mlが得られる)。残りは、蓋がネジ式のチューブに分注して.80℃に保存する。
      この後、「組換えアデノウイルス作製マニュアル ~クローン化ゲノム導入法~」の「組換えウイルスの超遠心による大量調製」に従って、ウイルス粒子を精製してください。

      組換えアデノウイルスの輸送ならびに保存時の安定性については Ugai, H. et al., Jpn. J. Cancer Res., 93, 598-603 (2002).をご覧ください。
  2. 配列と構造の検査
      組換えアデノウイルスに限らず、組換えDNAクローンは突然変異を起こす可能性があります。そこで、組込み遺伝子(ファイバー変異体アデノウイルスはファイバー領域も)の性状を実験の前にご自身で調べて下さい。その方法として、PCR、DNAシーケンシングあるいはウエスタンブロッティングが考えられます。
  3. 自律増殖ウイルス混入の検査
      理研DNA Bankの組換えアデノウイルスは、そのほとんどがCOS-TPC法により作製されており(Miyake S. et al., 1996)、自律増殖可能なアデノウイルス(Replication Competent Adenovirus, RCA)が混入する恐れがあります。また、組換えアデノウイルス増殖過程でも宿主であるHEK293細胞の持つE1遺伝子を組み換えにより獲得することが報告されています。そこで、組換えアデノウイルスをしようする前には、RCAが存在しないことを確認する必要があります。Suzuki E et al. (2004)にその方法を掲載しておりますのでご覧下さい。
  4. 組換えアデノウイルスの精製
      組換えアデノウイルスの簡便な精製法は、SOPのページのほか、Ugai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 331: 1053-1060 (2005)、 鵜飼ら、実験医学、羊土社、24, 981-985 (2006)、または、「組換えアデノウイルス作製マニュアル ~クローン化ゲノム導入法~」にも記載されています。

参考文献は Link & References をご覧下さい。
各リソースの詳しい情報は

http://dna.brc.riken.jp/search/
で検索可能です。

各リソースの一覧表は、

  寄託クローン シャトルベクター 組換えアデノウイルス
ヒト c_hum s_hum v_hum
マウス c_mou s_mou v_mou
全リスト c_all s_all v_all

で閲覧可能です。

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組換えウイルス・データベース

 理研BRC・遺伝子材料開発室では、組換えウイルスおよびウイルス作製ベクターを収集しております。新たに組換えウイルスまたは組換えウイルス作製用ベクター等の研究材料を開発された方は、ぜひ、当方に御寄託下さいますようお願い申し上げます。


http://dna.brc.riken.jp/rvd/index.html

 ただし、当バンクは、病原性ウイルスは扱うことができませんので、あらかじめご了承願います。

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組換えウイルス作製用シャトルベクター

組換えウイルス作製用シャトルベクター使用時の注意

  • 第二種使用等を目的とした遺伝子組換え生物です。
  • 宿主の名称ならびに組換え核酸の名称は、各クローンの詳細情報をご参照下さい。
  • 本ベクターは定められた実験条件下で定められた宿主細胞に導入した時に組換えウイルスを産生する様に設計されていますが、それ以外の条件下でウイルスが産生される可能性は否定できません。従いまして、ウイルス産生以外の目的で本ベクターを使用される場合は、十分に注意して下さい。

概要

  • 組換えアデノウイルスあるいは組換えレトロウイルスを産生するためのベクター(シャトルベクター)です。本クローンを然るべき条件下で定められた細胞株に導入することにより、組換えウイルスを得ることができます。(搭載遺伝子による細胞毒性等の理由から、一部のシャトルベクターからは組換えウイルスを産生できない場合があります)
  • 当開発室では基本業務として、国内ならびに海外において産出された遺伝子材料の寄託をうけ、検定後保存し品質管理したリソースを提供しています。本シャトルベクターは、研究で実際に使用されたクローンならびに当開発室で独自に開発したクローンを収集しており、他にはないユニークなものが多数あります。
    各リソースの詳しい情報は
    で検索可能です。

    各リソースの一覧表も閲覧可能です。
      寄託クローン シャトルベクター 組換えアデノウイルス
    ヒト c_hum s_hum v_hum
    マウス c_mou s_mou v_mou
    全リスト c_all s_all v_all
  • 一部のリソースに関しまして、検定の一環として行った末端塩基配列を、ホームページ上で公開しています。挿入遺伝子の両端をベクター側のプライマーを使用してシークエンスした結果(ドラフトシークエンス)を提示しています。この配列は寄託時にクローンに添えられる寄託書類の記載内容と比較することを目的として得たもので、リソースの全塩基配列を保証するものではありません。寄託者から提供された配列は下記をご覧下さい。
  • 組換えアデノウイルス産生用シャトルベクター(コスミドベクター)は、「アデノ落とし」によりプラスミドベクターに変換可能であり(制限酵素サイトの制約による一部のクローンを除く)、それにより発現ベクターとして使用できます。「アデノ落とし」については「実験医学 Vol. 21, No. 7 (5月号) クローズアップ実験法、寺島他 pp.931-936」をご覧下さい。また、実際例はShuttle Vector of Sugano Full-Length Human cDNA中のこちらをご覧下さい。

シャトルベクターからどの様にしてアデノウイルス粒子を得るのか?

    完全長ゲノム導入法
      下記のベクターをもとに作製されたシャトルベクターは、HEK293細胞に遺伝子導入することによりウイルス粒子の産生が可能です (Fukuda et al., 2006).
      • RDB3120 pAxcwit
      • RDB3121 pAxCAwtit
      • RDB5212 pAxcwit2
      • RDB5213 pAxCAwtit2
      • RDB5214 pAxCALNLwtit2
      • RDB5215 pAxEFwtit2
    COS-TPC法
      その他のシャトルベクターは、DNA-TPCを用い、「COS-TPC法」によりウイルス粒子を産生させます (Miyake et al., 1996)。DNA-TPC はRDB1747 Ad5-dlXから自作するほか、タカラバイオから入手可能です。
      www.takara-bio.co.jp/research.htm

    産生した組換えアデノウイルスも当開発室から提供可能です。本カタログの組換えアデノウイルスの項をご覧下さい。また、組換えレトロウイルス産生株は細胞材料開発室 (www.brc.riken.jp/lab/cell/) から提供しています。

Shuttle vector of Sugano full-length human cDNA

    東京大学医科学研究所 菅野純夫博士より提供していただいたヒト完全長cDNAを搭載したShuttle Vector of Sugano Full-Length Human cDNAを提供しています。オリゴキャップ法により単離構築されたcDNAクローンからインサートを切出し、組換えアデノウイルス作製用シャトルベクターに組込みました。組換えアデノウイルスの作製の他、「アデノ落とし」によりアデノウイルスゲノムの大部分を除いたプラスミドベクターを得ることができ、それを発現ベクターとして利用可能です。
    カテゴリー毎に分類した一覧表は、下記をご覧下さい。

目的遺伝子を持つシャトルベクターを構築する

  • 理研BRC・遺伝子材料開発室では、様々な用途に対応すべく、数多くのウイルス作製用バックボーンベクター提供しております。組換えアデノウイルス作製用バックボーンベクターの比較一覧は次のサイトから閲覧可能です。
    http://www.brc.riken.jp/lab/dna/rvd/allavector.html
  • ベクターの選択に関するお問い合わせは、電子メールをご利用ください。
  • 主なベクターの該略図を次にお示しします。
    Pdf fileはこちらから



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「組換えウイルス Q & A」

  1. 組換えアデノウイルスはどうやって作製しますか?

      概要を下記に図示しましたので、ご覧下さい。


      こちらから


  2. 組換えアデノウイルスの宿主になるHEK293細胞はどこで入手できますか?

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Links and References

ラボマニュアル

東京大学医科学研究所・遺伝子解析施設

札幌医科大学医学部・分子医学研究部門

理研脳科学総合研究センター・臨界期機構研究グループ・橋本研究ユニット

組換えアデノウイルスに関する参考文献
  1. 当研究室発表の総説
    村田武英、横山和尚:「即発現可能なcDNAの入手法 ~理研バイオリソースセンターを中心として~ 」バイオテクノロジージャーナル、羊土社、5, 644-648 (2005).

    村田 武英、鵜飼 英世、横山 和尚 (2003) 組換えウイルスバンクの創設と高度利用. バイオサイエンスとインダストリー, 61: 669-672.

    横山 和尚、鵜飼 英世、村田 武英 (2003) 新世紀の感染症学(下) - ゲノム・グローバル時代の感染症アップデート - II. 感染症の遺伝子学、ウイルスの遺伝子学、2本鎖直鎖状DNAウイルス、アデノウイルス. 日本臨床, 61: 601-607.

    横山 和尚、鵜飼 英世、村田 武英 (2003) 組換えウイルスの高度利用と組換えウイルス・コアバンクの基盤化. 細胞工学, 22: 448-454.

    特集「遺伝子治療の最前線 - 開発が進む次世代ベクター」監修/横山 和尚. 細胞工学, 20.
    1. 横山 和尚 (2001) 遺伝子治療の分子生物学. 細胞工学, 20: 1210-1214.
    2. 村田 武英、鵜飼 英世、鈴木 恵理香、横山 和尚 (2001) 組換えアデノウイルスの安全性. 細胞工学, 20: 1250-1254.

    李 海鴎、横山 和尚 (1995) 遺伝子発現シリーズ 7.ウイルスと転写因子 (1) アデノウイルスE1a遺伝子産物による転写調節. 臨床科学, 31: 1044-1049.


  2. 組換えアデノウイルスの取扱い
    Ugai H, Yamasaki T, Hirose M, Inabe K, Kujime Y, Terashima M, Liu B, Tang H, Zhao M, Murata T, Kimura M, Pan J, Obata Y, Hamada H, Yokoyama KK. (2005) Purification of infectious adenovirus in two hours by ultracentrifugation and tangential flow filtration. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331: 1053-1060.

    Suzuki E, Murata T, Watanabe S, Kujime Y, Hirose M, Pan J, Yamazaki T, Ugai H, Yokoyama KK. (2004) A simple method for the simultaneous detection of E1A and E1B in adenovirus stocks. Oncol Rep. 11: 173-178.

    H. Ugai, E. Suzuki, K. Inabe, T. Murata, H. Hamada, K. K. Yokoyama (2003) Spontaneous mutations in the human gene for p53 in recombinant adenovirus during multiple passages in human embryonic kidney 293 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 300: 448-456.

    鵜飼英世、寺島美保、村田武英、横山和尚:「組換えアデノウイルスの迅速な精製法 」実験医学、羊土社、24, 981-985 (2006).

    寺島 美保、近藤 小貫、鐘ヶ江 裕美、斎藤 泉 (2003) アデノウイルスベクターの簡便な作製法. 実験医学, 21: 931-936.

    実験医学別冊、新訂新遺伝子工学ハンドブック、改訂第3版、村松正實、山本雅編、1999年、(株)羊土社

    実験医学別冊、バイオマニュアルUPシリーズ、改訂版分子生物学研究のためのタンパク実験法、竹縄忠臣編、1998年、(株)羊土社

    別冊実験医学、ザ・プロトコールシリーズ、遺伝子導入&発現解析実験法、斎藤泉、菅野純夫編集、1997年、(株)羊土社

    実験医学別冊、バイオマニュアルUPシリーズ、遺伝子治療の基礎技術、島田隆、斎藤泉、小澤敬也編集、1996年、(株)羊土社

    ウイルス実験プロトコール、永井美之、石浜明監修、小林信之、永田恭介編集、1995年、メジカルビュー社

    実験医学別冊、バイオマニュアルシリーズ、遺伝子導入と発現・解析法、横田崇、新井賢一編集、1994年、(株)羊土社


  3. 組換えアデノウイルスの安定性
    Ugai, H., Watanabe, S., Suzuki, E., Tsutsui-Nakata, H., Yokoyama, K.K., Murata, T. (2002) Stability of a recombinant adenoviral vector: optimization of conditions for storage, transport and delivery. Jpn J Cancer Res., 93: 598-603.

    Croyle, M.A., Yu, Q.C., Wilson, J.M. (2000) Development of a rapid method for the PEGylation of adenoviruses with enhanced transduction and improved stability under harsh storage conditions. Hum Gene Ther. 11 (12): 1713-1722.

    Nyberg-Hoffman, C., Aguilar-Cordova, E. (1999) Instability of adenoviral vectors during transport and its implication for clinical studies. Nat Med. 5 (8): 955-957.


  4. 完全長ゲノム導入法による組換えアデノウイルスの作製
    Fukuda, H., Terashima, M., Koshikawa, M., Kanegae, Y., and Saito, I. (2006) Possible mechanism of adenovirus generation from a viral genome tagged with nucleotides at its ends. Microbiol Immunol. 50: 643-654.

  5. COS-TPC法による組換えアデノウイルスの作製
    Miyake S, Makimura M, Kanegae Y, Harada S, Sato Y, Takamori K, Tokuda C, Saito I. (1996) Efficient generation of recombinant adenoviruses using adenovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1320-1324.

  6. RCAに関する参考文献
    Suzuki E, Murata T, Watanabe S, Kujime Y, Hirose M, Pan J, Yamazaki T, Ugai H, Yokoyama KK. (2004) A simple method for the simultaneous detection of E1A and E1B in adenovirus stocks. Oncol Rep. 11: 173-178.

    村田武英、鵜飼英世、鈴木恵理香、横山和尚 (2001) 組換えアデノウイルスの安全性、細胞工学、Vol. 20, No. 9, 1250-1254.

    Fallaux FJ, Kranenburg O, Cramer SJ, Houweling A, Van Ormondt H, Hoeben RC, Van Der Eb AJ. (1996). Characterization of 911: a new helper cell line for the titration and propagation of early region 1-deleted adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 7: 215-222.

    Lochmuller H, Jani A, Huard J, Prescott S, Simoneau M, Massie B, Karpati G, Acsadi G. (1994). Emergence of early region 1-containing replication-competent adenovirus in stocks of replication-defective adenovirus recombinants (delta E1 + delta E3) during multiple passages in 293 cells. Hum. Gene Ther. 5: 1485-1491.

    Zhu J, Grace M, Casale J, Chang AT, Musco ML, Bordens R, Greenberg R, Schaefer E, Indelicato SR. (1999). Characterization of replication-competent adenovirus isolates from large-scale production of a recombinant adenoviral vector. Hum. Gene Ther. 10: 113-121.

  7. 293細胞のE1遺伝子を獲得することによるRCAの発生
    Hehir KM, Armentano D, Cardoza LM, Choquette TL, Berthelette PB, White GA, Couture LA, Everton MB, Keegan J, Martin JM, Pratt DA, Smith MP, Smith AE, Wadsworth SC (1996). Molecular characterization of replication-competent variants of adenovirus vectors and genome modifications to prevent their occurrence. J. Virol. 70: 8459-8467.

  8. RCA発生を抑制した宿主細胞
    Schiedner G, Hertel S, Kochanek S (2000) Efficient transformation of primary human amniocytes by E1 functions of Ad5: generation of new cell lines for adenoviral vector production. Hum. Gene Ther. 11: 2105-2116.

    Gao GP, Engdahl RK, Wilson JM (2000). A cell line for high-yield production of E1-deleted adenovirus vectors without the emergence of replication-competent virus. Hum. Gene Ther. 11: 213-219.

    Fallaux FJ, Bout A, van der Velde I, van den Wollenberg DJ, Hehir KM, Keegan J, Auger C, Cramer SJ, van Ormondt H, van der Eb AJ, Valerio D, Hoeben RC (1998). New helper cells and matched early region 1-deleted adenovirus vectors prevent generation of replication-competent adenoviruses. Hum. Gene Ther. 9: 1909-1917.

  9. アデノウイルスの感染効率
    Wickham et al., Nat. Biothech. 14, 1570-1573, 1996.

    Mizuguchi and Hayakawa, Gene 285, 69-77, 2002.

    Li et al., Mol. Cancer Ther. 4, 1850-1859, 2005.

    Huch et al., Hum. Gene Ther. 17, 1-14, 2006.

    Yoshida et al., Hum. Gene Ther. 9, 2503-2515, 1998.

    Nakamura et al., Hum. Gene Ther. 13, 613-626, 2002.

    Steinwaerder et al., Hum. Gene Ther. 11, 1933-1948, 2000.

    Dehari et al., Cancer Gene Ther. 10, 75-85, 2003.

    Bruning and Runnebaum, Gene Ther. 10, 198-205, 2003.

    Shayakhmetov and Lieber, J. Virol. Nov, 10274-10286, 2000.

    Israel et al., J. Virol. June, 5215-5221, 2001.

    Michiels F et al., Nat. Biotechnol. 20, 1154-1157, 2002.

    Michiels F et al. (2002). Arrayed adenoviral expression libraries for functional screening. Nat. Biotechnol. 20: 1154-1157.
    Table of infection efficiency of human cells and cell lines with standard Ad 5 viruses at the indicated Multiplicity of Infection (MOI). (form Michiels F et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 1154-1157)
    Cell typeOrigin of cells% efficiencyMOI
    Primary cells
    AdipocytesHuman liposuction tissue252500
    Bronchial epithelial cellsHuman lung701000
    Mast cellsCultured from human CD34+ cord blood cells252500
    CD14+ MonocytesHuman peripheral blood102500
    CD3+ T-lymphocytesHuman peripheral blood, naive32500
    Human OsteoblastsDifferentiated mesenchymal stem cells753000
    HUVECHuman umbilical cord vascular endothelium1001000
    Mesenchymal cells Human pluripotent bone marrow progenitors<101000
    Pre-adipocytesHuman liposuction tissue402500
    GM09503Human foreskin fibroblasts281000
    Cell lines
    A549Human lung carcinoma90250
    BxPC3Pancreatic cancer501000
    HaCatHuman keratinocyte471000
    HCT116Human fibroblast75100-500
    Hela-cellsHuman cervix tumor901000
    HepG2Human liver carcinoma8850
    JurkatHuman T lymphoma812500
    K562Human erythroid leukemia311000
    MCF-7Human breast cancer581000
    RamosHuman B-cell lymphoma132500
    SH-SY5YHuman neuronal tissue99250
    T47DHuman breast cancer68375
    U2OS Humanosteosarcoma87100

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(T.M.1999.03.23)
2013.10.16