PCR法によるMFGレトロウイルスベクター感染細胞（ΨCRIPシリーズ）の組換え遺伝子検出法に関する標準操作手順書

1. 目的

1.1

本標準操作手順書はPCR法によるMFGベクター感染細胞中の、目的の組換え遺伝子の検出について述べたものである。

1.2

本試験で用いるMFGベクター感染細胞の調製は               の記載に従う。

1.3

本試験で用いるMFGベクター感染細胞ゲノムDNAの調製はVirus Bank SOP-MFG-001の記載に従う。

2. 原理

2.1

MFGレトロウイルスベクターはMurine Moloney Leukemia Virus（MMLV）から改造されたものであり、細胞株yCRIPによりパッケージングされる。野生ウイルスのenvの部分に存在するXba I、あるいはNco I切断部位とBamH I切断部位の間に外来DNAが組み込まれている。これらの制限酵素切断部位の上流と下流に両側にプライマーを設定し、外来DNAをPCRで増幅して、特異的に検出する。

3. 試薬類

3.1

滅菌水、10×Ex Taq Buffer、dNTP mixture、TaKaRa Ex Taq（宝酒造）、Mineral oil（Sigma）

4. PCRプライマーの調製

4.1

インサートDNA増幅用のprimer #12: 5'-CTTCTCTAGGCGCCCATATG-3'、primer #13: 5'-GCCTGGACCACTGATATCCT-3'は、それぞれ滅菌精製水に終濃度10μMとなるように溶解する。

5. 操作手順（操作はすべて手袋をして、氷冷にて行う）

5.1

1回目のPCR反応液の組成

        25 μlのmineral oilで反応液の上を覆って、最高速で2秒間遠心する。

5.2

PCRサーマルサイクラーのプログラム

5.3

PCR終了後のPCR産物の検出はアガロースゲル電気泳動により実施する。泳動ゲルは以下の通り調製する。即ち、ミリQ水で希釈した1×TAE Bufferに懸濁したアガロース（1%、w/v）を電子レンジ等により加熱し、完全にアガロースが溶解したのを確認し、室温で固まらない程度まで冷却する。Mupid-2ゲルメーカーセット（アドバンス、#EM-2）にアガロースを流し込む。大プレート（W 107×L 60 mm）の場合35 ml、小プレート（W 52×L 60 mm）の場合は18 ml使用する。コーム（アドバンス、#COMB25、大プレート25ウェル、小プレート12ウェル）をセットしアガロースが固まるまで放置する。PCR産物5 μlに6×Gel-loading buffer（0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/30% glycerol）を1 μl添加し、そのうちの5 μlをゲルにアプライして1×TAEバッファー中、100 Vで30分間泳動する。

5.4

終濃度2 μg/mlのエチジウムブロマイドを添加したミリQ水に電気泳動後のゲルを浸し、室温で5分間放置する。その後、水道水で5分間洗浄する。UV（312 nm）照射により、デンシトグラフ（アトー、AE-6920M-03型）にライブ画像を取り込んだ後、PICTファイルとして保存する。バンドのサイズはインサートの長さプラス382 basesになる。

5.5

測定例を以下に示す。