DNAzol Genomic DNA Isolation Reagentによる培養細胞ゲノムDNA抽出に関する標準操作手順書

1. 目的

1.1

本標準操作手順書はDNAzol Genomic DNA Isolation Reagentによる細胞ゲノムDNA抽出について述べたものである。

2. 試薬類

2.1

DNAzol Genomic DNA Isolation Reagent（#10503-027）はGIBCO-BRL社製を使用する。

2.2

99.5%エタノール（#14713-95）、95%エタノール（#14711-15）はナカライテスク社製を使用する。

3. 培養細胞ゲノムDNA抽出の手順

3.1

付着細胞の場合、トリプシンを用い、2～5×10⁶のmonolayerをはがして、1.5 mlのエッペンドルフチューブに細胞ペレットを作る。浮遊細胞ならば、 ～10⁷の懸濁液を直接遠心し、1.5 mlのエッペンドルフチューブにペレットを作る。

3.2

1 ml のDNAzolを細胞ペレットの上に加え、ピペッティングして混合し、細胞の塊を残さないように懸濁する。

3.3

0.5 mlの99.5%エタノールを加え、5～8回転倒攪拌する。室温で1～分放置する。DNAzolとエタノールが均一になったことを確認する。雲のようなDNA沈殿が見えるはずである。

3.4

新しいエッペンドルフチューブに1 mlの95%エタノールを加えておく。マイクロピペットチップを使って、3.3のDNA沈殿をチップの先で巻き取って回収する。チップを95%エタノールのチューブに移し、素早く攪拌し、DNA沈殿を外す。

3.5

DNA沈殿が入ったチューブを3～回で転倒攪拌して、一分間放置する。DNAペレットがはがれないように注意しつつエタノールを捨てる。

3.6

1 mlの95%エタノールを加え、同じようにもう一回DNAペレットを洗う。

3.7

エタノールを完全に除き、適当量（50～100 μl）の滅菌蒸留水を加え、ピペッティングしてDNAを均一に溶解する。

3.8

分光光度計を用いて、波長260 nmでO.D.値を測して、DNAの濃度を計算する。

                    計算式：DNAの量(μg/ml)=O.D.₂₆₀ ×50

                    O.D.₂₆₀               x 50 =              (μg/mL)

3.9

DNA溶液を0.05 μg/μlに調製し、分注して-20^oCで保存する。

                     保存場所：