RT-PCR法によるC型肝炎ウイルス（HCV）ゲノムの定量に関する標準操作手順書

1. 目的

1.1

本標準操作手順書はRT-PCR法によるHCV感染細胞中のHCVゲノムの定量について述べたものである。

1.2

本試験で用いるHCV感染細胞の調製は               の記載に従う。

1.3

本試験で用いるcompetitor DNAの調製は               の記載に従う。

1.4

本試験で用いるサーマルサイクラー（MJ Research, PTC-200）の詳細な取扱いは               に、デンシトグラフ（アトー, AE-6920M-03型）の詳細な取扱いは               に従う。

2. 原理

2.1

HCV感染細胞より抽出したtotal RNAを鋳型として、competitor DNAを内部標準としたRT-PCR法により、HCVゲノム中で比較的塩基配列が保存されている5'非翻訳領域のcDNAを増幅し、さらにnested PCRを行った後、アガロースゲル電気泳動にて内部標準のcompetitor DNAとの比率から感染細胞中のHCVゲノムの定量を行うものである。

3. 試薬類

3.1

ISOGEN（Cat. No. 311-02501）はニッポンジーン社、dNTP mixture（#27-2035-02）はPharmacia Biotech社、ジエチルピロカーボネート（DEPC）処理水（#364-15）はナカライテスク社、AMV逆転写酵素（#120248）は生化学工業、AmpliTaq DNA Polymerases with buffer（#N-808-0160）はPerkin-Elmer社、アガロース（#A6013）はSigma社、50×TAEバッファー（#24710-030）、5×First Strand Buffer、0.1 M DTT（#18057-018）はGIBCO BRL社製を使用する。

4. PCRプライマーの調製

4.1

HCVゲノム増幅用の1st sense primer #5: 5'-AGTATGAGTGTCGTGCAGCCT-3'、1st antisense primer #8: 5'-GCACTCGCAAGCACCCTATCA-3'、2nd sense primer #6: 5'-AGCCATAGTGGTCTGCGGAAC-3'、2nd antisense primer #7: 5'-TACCACAAGGCCTTTCGCGAC-3'を合成し、それぞれDEPC処理水に終濃度10 μMとなるように溶解する。

5. 操作手順

5.1

HCV感染ヒト肝細胞を1 mlのPBSで3回洗浄した後、ISOGEN 500 μlを添加し、十分ピペッティングする。ISOGEN可溶化サンプルを1.5 ml容のエッペンドルフチューブに移し、total RNAの調製に持ち込む。直ちにRNA抽出を行わないサンプルは- 80℃のフリーザーにストックする（少なくとも1ヶ月は保存可能）。

5.2

ISOGEN可溶化サンプルにクロロホルム200 μl/チューブを添加し、vortex mixerで15秒間遠心後、室温で3分間静置する。次に20,000×g（半径9 cm, 14000 rpm）、4℃で15分間遠心した後、上清（水相）300 μlをグリコーゲン添加エッペンドルフチューブ（2 μl/チューブ、遠心中に準備）に加え、更にイソプロピルアルコール300 μlを添加後に10秒間撹拌する。撹拌したサンプルは- 80℃に30分間放置する（overnightも可能）。20,000×g、4℃で15分間遠心後、上清を除去（多少上清が残っても良い）し、70 %エタノールを700 μl添加する。撹拌せずに20,000×g、4℃で5分間遠心した後、上清を除去し、そのまま1分間遠心して壁に付着したエタノールを完全に落とす。最後にマイクロピペットで完全に上清を除去する（この時完全に乾燥させないように注意する）。

5.3

RT（Reverse Transcription）反応は以下の方法で実施する。即ち、下記のRT-1溶液を抽出したtotal RNAに添加し（30 μl/チューブ）、vortex mixerで撹拌溶解後、氷上に静置する。沸騰したお湯で5分間インキュベートし、氷水にて急冷した後（5分以上）、20,000×g、4℃でflash遠心して壁に付着した水滴を落とす。2～3回ピペッティングした後、12 μlをRT-PCR用チューブに分注し、下記のRT-2溶液8 μlを添加後、ピペッティングする。43℃に設定したサーマルサイクラー（MJ Research, PTC-200）で30分間インキュベートし、更に99℃で5分間インキュベートした後、4℃で保存する（RT-1、RT-2はRNA抽出のクロロホルム添加後の遠心時に調製する。但しRT-2へのAMV-RTase添加は本項の「沸騰したお湯で5分間インキュベートし、氷水にて急冷」中に実施）。

      ●RT-1溶液の組成（RNAサンプル1本当たり）

      ●RT-2溶液の組成（RNAサンプル1本当たり）

5.4

RT反応により得られたcDNAを以下の方法により増幅する（1st PCR）。即ちcDNAを5 μlずつ3本のRT-PCR用チューブに分注し、各濃度の内部標準competitor DNA（103、104、105 copies/チューブ）を含む1st PCR溶液を45 μl添加する。ピペッティング後、以下に示すプログラムを設定したサーマルサイクラーによりPCRを実施する。

      ● PCRにおけるサーマルサイクラーのプログラム

      ●1st PCR溶液（cDNA 1サンプル当たり）

5.5

1st PCR後のサンプル5 μlを新しいPCR用チューブに添加し、さらに以下に示す2nd PCR溶液45 μlを添加し、ピペッティング後、1st PCRと同様のプログラムで2nd PCRを実施する。

      ● 2nd PCR溶液（cDNA 1サンプル当たり）

5.6

PCR終了サンプルのcDNAの検出はアガロースゲル電気泳動により実施する。泳動ゲルは以下の通り調製する。即ち、ミリQ水で希釈した1×TAEバッファーに懸濁したアガロース（3%、w/v）を電子レンジ等により加熱し、完全にアガロースが溶解したのを確認し、室温で固まらない程度まで冷却する。Mupid-2ゲルメーカーセット（アドバンス, #EM-2）の大プレートに40 mlのアガロースを流してゲルを作製する。2nd PCR産物10 μlに6×Gel-loading buffer（0.25% bromophenol blue/0.25% xylene cyanol/30% glycerol）を2 μl添加し、そのうちの10 μlをゲルにアプライして1×TAEバッファー中、100 Vで30分間泳動する。

5.7

終濃度2 μg/mlのエチジウムブロマイドを添加したミリQ水に電気泳動後のゲルを浸し、室温で10分間放置する。その後、水道水で5分間洗浄する。UV（312 nm）照射により、デンシトグラフ（アトー, AE-6920M-03型）にライブ画像を取り込んだ後、解析ソフトウエア「ゾーンデンシトメトリー」によりHCV cDNAとcompetitor DNAのバンドの強度を定量する。データはExcelのテキストファイルとして保存する。

6. 計算

6.1

ゾーンデンシトメトリーによる解析データをコンピューターソフトウエア"Microsoft Excel 5.0"を用いてHCVゲノムのコピー数を算出する。例えば、105 copiesのcompetitorのバンドとHCV由来のcDNAのバンドの比（HCVゲノム/competitor）が1±0.1の範囲内であれば、最初に含まれるHCV RNAはcompetitorのコピー数と同じであると判断し、105と104 copiesの間であれば両者の中間値104.7 copiesであると判断する。得られた値を10倍した値がウエル当たりのHCVゲノムのコピー数となる。

6.2

プリントアウトし、必要事項を記入し報告用紙とする。

6.3

測定例を以下に示す。